GIÁM SÁT VI KHUẨN LISTERIA MONOCYTOGENES VÀ NGHIÊN CỨU THỜI HẠN SỬ DỤNG CỦA THỰC PHẨM ĂN LIỀN (RTE)

by admin , 20/05/2026

Chương 9

GIÁM SÁT VI KHUẨN LISTERIA MONOCYTOGENES VÀ NGHIÊN CỨU THỜI HẠN SỬ DỤNG CỦA THỰC PHẨM ĂN LIỀN (RTE)

Chương này được biên soạn dựa trên Tài liệu hướng dẫn về giám sát vi khuẩn Listeria monocytogenes (Lm) và nghiên cứu thời hạn sử dụng của thực phẩm ăn liền theo Quy định của Ủy ban Châu Âu (EC) số 2073/2005 ngày 15 tháng 11 năm 2005 về các tiêu chí vi sinh

đối với thực phẩm và Tài liệu hướng dẫn kỹ thuật của EURL Lm về các thử nghiệm thử thách và nghiên cứu độ bền để đánh giá thời hạn sử dụng của thực phẩm ăn liền liên quan đến Listeria monocytogenes. Phiên bản 4, ngày 1 tháng 7 năm 2021.

Khái quát

1.1. Thực phẩm ăn liền – Ready-To-Eat foods (RTE)

Thực phẩm ăn liền được định nghĩa trong Quy định của Ủy ban Châu Âu (EC) số 2073/2005 – Điều 2 là ” thực phẩm do nhà sản xuất hoặc nhà chế biến dự định dùng trực tiếp cho con người mà không cần nấu chín hoặc chế biến khác có hiệu quả để loại bỏ hoặc giảm xuống mức chấp nhận được các vi sinh vật gây hại “.

1.2. Hạn sử dụng

Hạn sử dụng của thực phẩm được định nghĩa là khoảng thời gian mà sản phẩm vẫn an toàn và đáp ứng các tiêu chuẩn chất lượng trong điều kiện bảo quản, phân phối và sử dụng có thể dự đoán được một cách hợp lý (theo Quy định EC 2073/2005). Thời hạn sử dụng này tương ứng với khoảng thời gian trước đó:

“Ngày hết hạn sử dụng”, tức là ngày cuối cùng sản phẩm thực phẩm phải được sử dụng. Trong trường hợp này, hạn sử dụng liên quan đến an toàn thực phẩm.
“Ngày hết hạn sử dụng tối thiểu” hay “ngày tốt nhất nên dùng trước” là ngày mà thực phẩm vẫn giữ được các đặc tính cụ thể của nó khi được bảo quản đúng cách. Điều này chủ yếu liên quan đến chất lượng thực phẩm (hình thức, mùi, kết cấu, hương vị, …).

Thời hạn sử dụng về vi sinh của thực phẩm tương ứng với khoảng thời gian mà thực phẩm đó vẫn nằm trong giới hạn vi sinh định lượng đã được xác định trước. Thời hạn này bắt đầu từ thời điểm thực phẩm được sản xuất và/hoặc đóng gói.

1.3. Thử nghiệm thử thách (challenge test).

Thử nghiệm thử thách là một nghiên cứu trong phòng thí nghiệm được sử dụng để đánh giá độ an toàn vi sinh của một sản phẩm. Thử nghiệm sẽ đánh giá xem sản phẩm có khả năng hỗ trợ sự phát triển của Lm hay không.

Các thử nghiệm thử thách nhằm mục đích xác nhận thời hạn sử dụng của sản phẩm thực phẩm trong điều kiện bảo quản nhất định bằng cách cung cấp thông tin về hành vi của Lm (tăng trưởng, tồn tại hoặc suy giảm) khi được cấy nhân tạo. Các thử nghiệm thử thách cần xem xét sự biến động của các lô hàng, mẫu thực phẩm và chủng vi khuẩn. Mức độ ô nhiễm, tính không đồng nhất của ô nhiễm và trạng thái sinh lý của vi khuẩn rất khó mô phỏng trong một thử nghiệm thử thách. Do đó, phương pháp gây ô nhiễm không phải lúc nào cũng có thể mô phỏng hoàn toàn sự ô nhiễm tự nhiên.

Trong nghiên cứu thử thách Lm có hai dạng như sau:

Tiềm năng tăng trưởng (Growth potential): Nhiễm nhân tạo Lm vào sản phẩm với nồng độ ban đầu thấp. Sau đó theo dõi sự thay đổi nồng độ Lm suốt thời hạn sử dụng, dưới điều kiện bảo quản hợp lý.
Tốc độ tăng trưởng tối đa (Maximum growth rate): Nhiễm nhân tạo Lm với nồng độ cao để đo tốc độ tăng trưởng tối đa (μ_max) ở điều kiện cụ thể (nhiệt độ, pH, a_w…). Dùng để dự báo tăng trưởng nếu có ô nhiễm ban đầu để ước lượng mức cuối thời hạn sử dụng.

Bảng 9.1 nêu rõ những lợi ích/hạn chế của các thử nghiệm thử thách nhằm đánh giá tiềm năng tăng trưởng, tốc độ tăng trưởng tối đa và các nghiên cứu về độ bền.

Bảng 9.1. Những hạn chế và thách thức của các nghiên cứu hạn sử dụng
Loại hình nghiên cứu	Lợi ích	Hạn chế
Thử nghiệm thử thách – Tiềm năng tăng trưởng (Δ)	– Công cụ tốt để thẩm định thời hạn sử dụng. – Tính toán giá trị Δ dựa trên một công thức đơn giản. – Giá trị Δ cho phép xác định thực phẩm ăn liền có hỗ trợ sự phát triển của Lm hay không. – Các thí nghiệm yêu cầu ít đơn vị mẫu thử hơn so với thí nghiệm xác định tốc độ tăng trưởng tối đa.	– Kết quả bị giới hạn trong các điều kiện được sử dụng trong nghiên cứu; không thể ngoại suy. – Cần thông tin về biểu đồ thời gian/nhiệt độ để mô phỏng các điều kiện bảo quản có thể dự đoán được của thực phẩm RTE. – Cần các tủ ấm để tái tạo chính xác biểu đồ nhiệt độ đã xác định.
Thử nghiệm thử thách – Tốc độ tăng trưởng tối đa (µ _max)	– Công cụ tốt để thẩm định thời hạn sử dụng. – Có thể ngoại suy kết quả cho các điều kiện khác. – Thí nghiệm được thực hiện ở nhiệt độ không đổi do phòng thí nghiệm lựa chọn. – Tiết kiệm thời gian khi đánh giá thời hạn sử dụng dài. – Sử dụng µ _max trong các mô hình vi sinh dự báo giúp ước tính mức độ nhiễm Lm trong các điều kiện môi trường khác nhau.	– Cần có kiến thức về vi sinh dự báo và kỹ năng sử dụng các phần mềm vi sinh dự báo. – Cần thực hiện nhiều thí nghiệm hơn ở các khoảng thời gian định sẵn, do đó yêu cầu nhiều đơn vị mẫu thử hơn. – Các chủng vi khuẩn được kiểm tra riêng biệt. – Khi không tính đến giai đoạn tiềm phát (lag-phase), thử nghiệm như vậy có thể đánh giá cao quá mức nồng độ Lm trong sản phẩm được kiểm tra.
Nghiên cứu độ bền (Durability study)	– Công cụ tốt để xác nhận thời hạn sử dụng đã thiết lập. – Dễ dàng triển khai tại phòng thí nghiệm, không cần thiết bị đặc dụng. – Không có sai lệch liên quan đến trạng thái sinh lý của vi khuẩn trong thực phẩm vì sử dụng sự nhiễm khuẩn tự nhiên. – Có thể tập hợp các nghiên cứu độ bền để tăng mức độ tin cậy cho thời hạn sử dụng đã thiết lập.	– Nếu đứng đơn lẻ thì không phù hợp để thẩm định thời hạn sử dụng vi sinh của thực phẩm RTE. – Không thể kiểm tra tất cả các điều kiện bảo quản có thể dự đoán được. – Không thể ngoại suy kết quả cho các điều kiện khác. – Cần thông tin về biểu đồ thời gian/nhiệt độ để mô phỏng các điều kiện bảo quản có thể dự đoán được của thực phẩm RTE. – Cần có một lượng kết quả đáng kể để có độ tin cậy cao hơn trong việc giải thích thống kê.

1.4. Nghiên cứu về độ bền (Durability studies)

Nghiên cứu độ bền nhằm mục đích kiểm tra xác nhận thời hạn sử dụng của một sản phẩm thực phẩm trong điều kiện bảo quản nhất định. Nghiên cứu này đánh giá sự phát triển hoặc khả năng sống sót của Lm, chúng có thể có mặt tự nhiên trong thực phẩm trong suốt thời hạn sử dụng, trong các điều kiện phân phối, bảo quản và sử dụng có thể dự đoán được một cách hợp lý.

Việc lựa chọn các nghiên cứu cần thực hiện do doanh nghiệp quyết định, nếu cần thiết thì với sự hợp tác của phòng thí nghiệm có năng lực sẽ tiến hành nghiên cứu đó. Sự lựa chọn nên dựa trên thông tin cần thu được, như minh họa trong Hình 9.1, hình này trình bày các loại nghiên cứu khả thi để xác định sự phát triển của Lm trong thực phẩm ăn liền và kết quả thu được từ mỗi loại.

Khi nào thực hiện thử nghiệm thử thách hoặc thử độ bền cho thực phẩm ăn liền

2.1. Thử nghiệm thử thách

Trong các trường hợp sau thực phẩm ăn liền phải bắt buộc thử nghiệm thử thách:

2.1.1. Sản phẩm có khả năng hỗ trợ sự phát triển của L. monocytogenes

Sản phẩm có điều kiện sau là trường hợp hỗ trợ sự phát triển của L. monocytogenes

pH > 4.4.
a_w > 0.92.
hoặc pH > 5.0 và aw > 0.94.
Không có rào cản bảo quản đủ mạnh khác.

Trong trường hợp này, sản phẩm không thể chứng minh bằng thông số nội tại đơn giản, nên cần dữ liệu thực nghiệm để xác định Tiềm năng tăng trưởng (Δ).

Thử nghiệm thử thách

Tiềm năng tăng trưởng

(nhiễm nhân tạo)

Thử nghiệm thử thách

Tốc độ tăng trưởng tối đa

(nhiễm nhân tạo)

Nghiên cứu độ bền

(ô nhiễm tự nhiên)

“Δ”

Tiềm năng tăng trưởng

“μ max” hoặc Vmax

Tốc độ tăng trưởng tối đa

RTE không thể hỗ trợ sự phát triển của Lm (Δ ≤ 0.5 log)

RTE có thể hỗ trợ sự phát triển của Lm (Δ > 0.5 log)

μ max ở điều kiện cụ thể

Nồng độ Lm ban đầu

Nồng độ Lm cao nhất trong suốt thời gian đã nghiên cứu

Nồng độ Lm tại bất kỳ giai đoạn nào trong thời gian bảo quản đã nghiên cứu

Nồng độ Lm ban đầu

Tỷ lệ các đơn vị sản phẩm > 100 cfu/g vào cuối thời hạn sử dụng

Hình 9.1. Kết quả thu được từ mỗi loại nghiên cứu thử thách

2.1.2. Khi không có đủ dữ liệu khoa học tương đương

Các sản phẩm không có đủ dữ liệu khoa học tương đương và sản phẩm có thời hạn sử dụng dài (>5 ngày). Các đối tượng sản phẩm như:

Không có tài liệu khoa học chứng minh sản phẩm tương tự không hỗ trợ tăng trưởng.
Không thể dùng mô hình dự đoán đáng tin cậy.
Công thức hoặc quá trình là mới.

Trong các trường hợp này phải thực hiện Thử nghiệm thử thách để chứng minh.

2.2. Các trường hợp miễn trừ

Theo FAO, Các tài liệu hướng dẫn về sự tăng trưởng của Lm trong thực phẩm ăn liền đưa ra các điều kiện không xảy ra sự hỗ trợ tăng trưởng Lm nếu:

(a) thực phẩm có độ pH nhỏ hơn 4,4 bất kể hoạt độ nước.

(b) thực phẩm có hoạt độ nước nhỏ hơn 0,92 bất kể độ pH.

(d) thực phẩm có thời hạn sử dụng lạnh không quá 5 ngày.

(e) thực phẩm được đông lạnh (bao gồm cả thực phẩm được tiêu thụ đông lạnh và những thực phẩm dự định được rã đông ngay trước khi tiêu thụ).

(f) có thể xác nhận rằng mức độ Lm sẽ không tăng quá 0,5 log CFU/g trong suốt thời hạn sử dụng đã nêu của thực phẩm.

Ngoài ra, theo Quy định của Ủy ban EC số 2073/20, các sản phẩm sau đây có thể không bắt buộc.

Sản phẩm có thời hạn sử dụng dưới 5 ngày.
Các sản phẩm đã trải qua quá trình xử lý hiệu quả để loại bỏ Lm, khi việc tái nhiễm không thể xảy ra sau quá trình xử lý này.
Rau củ quả tươi, chưa cắt và chưa qua chế biến.
Bánh mì, bánh quy và các sản phẩm tương tự.
Nước đóng chai hoặc đóng gói, nước ngọt, bia, rượu táo, rượu vang, rượu mạnh và các sản phẩm tương tự.
Đường, mật ong và bánh kẹo, bao gồm ca cao và các sản phẩm sô cô la.
Động vật thân mềm hai mảnh vỏ còn sống.
Muối dùng trong thực phẩm.

Thử nghiệm thử thách

Trong thực phẩm, nhiều yếu tố hoặc sự kết hợp của các yếu tố có thể ảnh hưởng đến sự phát triển của Lm. Các yếu tố này được chia thành các thông số bên trong và bên ngoài. Các thông số bên trong (liên quan đến bản thân thực phẩm) bao gồm độ pH, hoạt độ nước (a_w), NaCl, hàm lượng ẩm, hệ vi sinh vật nền, hàm lượng dinh dưỡng và cấu trúc của thực phẩm, hàm lượng chất bảo quản. Các yếu tố bên ngoài (liên quan đến môi trường bảo quản thực phẩm) bao gồm thành phần khí, độ ẩm tương đối, bao bì và điều kiện bảo quản theo thời gian và nhiệt độ.

Một số yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển của Lm có thể thay đổi trong cùng một lô (biến động nội lô) hoặc giữa các lô (biến động liên lô), và những biến động này cần được đánh giá trước khi bắt đầu thử nghiệm thử thách.

3.1. Các điều kiện ban đầu khi thực hiện thử nghiệm thử thách

Trước khi bắt đầu thử nghiệm thử thách, tổ chức cần xác định những thông tin liên quan đến sản phẩm đang được nghiên cứu. Bước đầu tiên này có nhiều mục tiêu và cho phép thực hiện những điều sau:

Xác định các yếu tố ảnh hưởng đến sự tăng trưởng của Lm và ưu tiên đo lường các yếu tố này.
Đánh giá các nguồn biến thiên của các yếu tố đặc trưng cho sản phẩm và quy trình sản xuất.
Chứng minh rằng các sản phẩm được phân tích trong các bài thử nghiệm thử thách là đại diện cho sản phẩm sản xuất thực tế.

Thông tin sản phẩm cần thiết như sau:

Mô tả sản phẩm (tên thương mại của sản phẩm, trọng lượng, …), công thức mới, sản phẩm mới hoặc sản phẩm có lịch sử sản xuất.
Các điều kiện chế biến (ít nhất là các điều kiện liên quan trong quy trình sản xuất: Ví dụ như xử lý nhiệt, sấy khô, hun khói, làm chín, thái lát, băm nhỏ, đông lạnh, rã đông, ướp muối, đóng gói,…)
Thành phần của sản phẩm (ghi trên bao bì sản phẩm).
Đặc điểm sản phẩm bao gồm sự biến động giữa và trong các lô sản phẩm. Điều quan trọng cần lưu ý là, đối với một số loại thực phẩm, nếu giá trị của một số đặc điểm nhất định thay đổi trong suốt thời hạn sử dụng (ví dụ: giá trị pH trong các sản phẩm lên men, phô mai; hoặc giá trị a_w trong giăm bông khô, phô mai cứng).
Tình trạng bao bì của sản phẩm cuối cùng (bao gồm cả ảnh sản phẩm).
Điều kiện bảo quản trong suốt thời hạn sử dụng (có tính đến các điều kiện có thể dự đoán được trong quá trình vận chuyển, bảo quản tại nhà sản xuất, tại cửa hàng bán lẻ và ở cấp độ người tiêu dùng).
Thời hạn sử dụng, hướng dẫn sử dụng được khuyến nghị (trên bao bì) và các điều kiện sử dụng có thể dự đoán được một cách hợp lý của sản phẩm.

Dữ liệu lịch sử là quá trình quan trọng trong việc đánh giá việc sản xuất, lưu trữ và phân phối sản phẩm. Các dữ liệu lịch sử như:

Giấy chứng nhận phân tích (CoA) từ các nhà cung cấp nguyên liệu.
Kiểm tra giám sát định kỳ thường xuyên tại tổ chức (ví dụ: nhiệt độ, độ pH, độ ẩm,…).
Kiểm tra vi sinh vật trong phòng thí nghiệm đối với các nguyên liệu được cung cấp.
Kiểm tra vi sinh sản phẩm hoàn thiện trong suốt thời hạn sử dụng.
Kiểm tra vi sinh vật trong phòng thí nghiệm đối với mẫu nước và môi trường.
Ghi chép về quy trình vệ sinh và khử trùng.
Hồ sơ về các biện pháp khắc phục liên quan đến kết quả không đạt yêu cầu.
Hồ sơ khiếu nại.
Hồ sơ về việc thu hồi và rút sản phẩm.
Hồ sơ kiểm soát chính thức.

Các ví dụ về cách đánh giá, dựa trên lượng dữ liệu lịch sử hiện có, liệu các đặc điểm của các lô hàng được nghiên cứu có phản ánh sự biến động quan sát được trong điều kiện xử lý bình thường hay không, được trình bày bên dưới.

Ví dụ 1: Trường hợp tổ chức có nhiều dữ liệu lịch sử (sản phẩm được tổ chức sản xuất trong nhiều năm). Trường hợp, tổ chức sản xuất sản phẩm có pH 5.5 – 5.7.

Việc thu thập dữ liệu do tổ chức ghi lại ở cấp độ sản xuất trong nhiều năm cung cấp thông tin tốt về sự phân bố các phép đo pH trên sản phẩm thương mại hóa (Hình 9.2).

Hình 9.2. Biểu đồ phân bố tần suất giá trị pH của thực phẩm RTE dựa trên dữ liệu lịch sử

Dựa trên sự phân bố các phép đo pH này, các mẫu thực phẩm đối chứng trong thử nghiệm thử thách có thể được coi là đại diện cho sự biến động của quy trình sản xuất, nếu giá trị pH của chúng nằm trong phạm vi 90 % của dữ liệu lịch sử.

Ví dụ 2: Trường hợp tổ chức có dữ liệu lịch sử hạn chế (sản phẩm mới sản xuất).

Tổ chức đã tiến hành phân tích đặc điểm của ba lô sản phẩm thực phẩm chỉ với một phép đo cho mỗi lô (Bảng 9.2).

Bảng 9.2. Bảng các đặc tính lý hóa và vi sinh của thực phẩm ăn liền (RTE)

	pH	a_w	Chất bảo quản	Tổng số vi sinh vật
Lô 1	5.5	0,98	1,0 %	3.10⁴
Lô 2	5.1	0,98	1,5 %	9.10⁴
Lô 3	5,2	0,98	1,2 %	5.10⁴

Trong trường hợp này, không thể đánh giá liệu các lô hàng được thử nghiệm có đại diện cho quá trình sản xuất hay không. Việc mô tả đặc điểm của sản phẩm với dữ liệu hạn chế như vậy là không đáng tin cậy. Cần có ít nhất 5 giá trị cho mỗi yếu tố trong mỗi lô hàng.

Ngoài hai ví dụ trên, các ví dụ dưới đây giúp tổ chức có thể đánh giá tốt tiềm năng nhiễm khuẩn và điều kiện bảo quản sản phẩm.

Ví dụ về những trường hợp dữ liệu lịch sử có thể hữu ích:

Trường hợp nồng độ Lm trong thực phẩm ăn liền vào cuối hạn sử dụng luôn ở mức thấp hoặc không có và không có kết quả nào vượt quá giới hạn tiêu chuẩn vi sinh pháp lý được quy định trong Quy định của Ủy ban EC số 2073/2005. Dữ liệu này có thể được sử dụng kết hợp với dữ liệu từ việc lấy mẫu môi trường và chất lượng nguyên liệu để giúp các tổ chức tin tưởng rằng các loại thực phẩm ăn liền này sẽ không gây rủi ro cho sức khỏe cộng đồng. Mức độ tin cậy tăng lên theo lượng dữ liệu có sẵn. Càng nhiều sản phẩm được kiểm tra, dữ liệu lịch sử càng đáng tin cậy hơn.
Dữ liệu lịch sử về nồng độ Lm trong các thực phẩm ăn liền hiện có ở thời điểm bắt đầu và kết thúc hạn sử dụng có thể được sử dụng để giúp kiểm tra xác nhận hạn sử dụng của sản phẩm trong các điều kiện chế biến, bảo quản, phân phối và sử dụng có thể dự đoán được một cách hợp lý.
Dữ liệu lịch sử về nồng độ Lm trong các thực phẩm ăn liền hiện có ở thời điểm bắt đầu và kết thúc hạn sử dụng cũng có thể được sử dụng để kiểm tra xác nhận khả năng phát triển của nó trong các thực phẩm ăn liền tương tự với các đặc điểm tương đương (pH, độ ẩm, vi sinh vật bản địa, …) được sản xuất trong điều kiện gần như giống hệt nhau.
Dữ liệu lịch sử sẽ cho biết mức độ Lm được tìm thấy trong môi trường sản xuất, nguyên liệu tươi sống và thực phẩm ăn liền hiện có, theo các thực hành GHP và HACCP hiện hành của hoạt động kinh doanh thực phẩm.
Việc thu thập dữ liệu lịch sử cũng rất quan trọng để hiểu được sự biến động tiềm tàng giữa các lô và trong cùng một lô của các thông số quan trọng kiểm soát Lm.

3.2. Thử nghiệm thử thách – Tiềm năng tăng trưởng

3.2.1. Mục đích

Thử nghiệm thử thách vi sinh đánh giá tiềm năng tăng trưởng (Δ) là một nghiên cứu trong phòng thí nghiệm đo lường sự phát triển của Lm trong thực phẩm được gây nhiễm nhân tạo và được bảo quản trong điều kiện có thể dự đoán ở cấp độ nhà sản xuất, bán lẻ và người tiêu dùng. Thử nghiệm thử thách phải phản ánh các điều kiện có thể dự đoán được xảy ra trong toàn bộ chuỗi lạnh, bao gồm cả điều kiện bảo quản giữa sản xuất và tiêu dùng. Thời gian thử nghiệm bắt đầu từ ngày gây nhiễm và kết thúc vào cuối thời hạn sử dụng.

Tiềm năng tăng trưởng (Δ) là sự khác biệt giữa nồng độ Lm cao nhất được quan sát thấy tính bằng log₁₀ cfu/g trong suốt quá trình thử nghiệm và nồng độ Lm ban đầu tính bằng log₁₀cfu/g ở thời điểm bắt đầu thử nghiệm. Mục đích thử nghiệm này nhằm:

Phân loại sản phẩm: Hỗ trợ sự tăng trưởng” hoặc “không hỗ trợ sự tăng trưởng”;
Làm cơ sở thiết lập thời hạn sử dụng (shelf-life);
Đáp ứng Regulation (EC) 2073/2005.

Tuy nhiên, thử nghiệm thử thách có nhược điểm là thiếu tính linh hoạt trong việc diễn giải: kết quả chỉ có giá trị đối với sản phẩm được thử nghiệm trong các điều kiện cụ thể, do đó cần phải tiến hành các thí nghiệm mới mỗi khi có sự thay đổi (ví dụ: sử dụng các cấu hình nhiệt độ – thời gian khác nhau, thay đổi thành phần hoặc công thức).

3.2.2. Đối tượng áp dụng

Áp dụng cho:

Sản phẩm RTE có thời hạn sử dụng > 5 ngày.
Sản phẩm có pH > 4.4 và a_w > 0.92.
Trường hợp không đủ bằng chứng khoa học thay thế.

3.2.3. Nguyên tắc

Sản phẩm được cấy hỗn hợp chủng đại diện của Lm với mật độ ban đầu xác định, sau đó bảo quản theo điều kiện dự kiến và phân tích định lượng tại nhiều thời điểm.

Tiềm năng tăng trưởng = Δ = log₁₀N__cuối – log₁₀N__Đầu

N__Đầu = mật độ trung bình ngay sau cấy (T₀)
N__Cuối = mật độ cao nhất ghi nhận trong thời hạn sử dụng.

3.2.4. Thiết kế thử nghiệm

3.2.4.1. Lựa chọn chủng vi khuẩn

Để tính đến sự khác biệt về tốc độ sinh trưởng và khả năng sống sót giữa các chủng Lm, cần thực hiện thử nghiệm thử thách với hỗn hợp các chủng Lm. Cùng một chủng Lm sẽ được sử dụng cho cả ba mẻ thử nghiệm. Yêu cầu:

Nên chọn tối thiểu 3 chủng;
Đại diện các serotype liên quan đến thực phẩm;
Có thể bao gồm:
Chủng tham chiếu (ví dụ ATCC);
Chủng phân lập từ thực phẩm tương tự;
Chủng phân lập từ môi trường nhà máy.

Chủng phải:

Không suy giảm độc lực do cấy truyền nhiều lần;
Được bảo quản đúng chuẩn.

Bảng 9.3. Lựa chọn chủng vi sinh vật dựa trên khả năng sinh trưởng liên quan đến nguồn gốc, điều kiện và kiểu gen.

Nguồn gốc	Sản phẩm thịt
Kiểu huyết thanh	Giá trị a_wthấp (a_w= 0,95)	Độ pH thấp (pH = 5)	Nhiệt độ thấp (T = 8 °C)
II	12MOB045LM	12MOB045LM	12MOB045LM
II	12MOB046LM	12MOB046LM	12MOB046LM
IV	12MOB085LM	12MOB112LM	12MOB085LM
IV	12MOB089LM	12MOB089LM	12MOB089LM
Nguồn gốc	Sản phẩm cá
Kiểu huyết thanh	Giá trị a_wthấp (a_w= 0,95)	Độ pH thấp (pH = 5)	Nhiệt độ thấp (T = 8 °C)
II	12MOB101LM	12MOB101LM	12MOB099LM
II	12MOB100LM	12MOB100LM	12MOB101LM
IV	12MOB103LM	12MOB103LM	12MOB102LM
IV	12MOB102LM	12MOB102LM	12MOB107LM
Nguồn gốc	Sản phẩm từ sữa
Kiểu huyết thanh	Giá trị a_wthấp (a_w= 0,95)	Độ pH thấp (pH = 5)	Nhiệt độ thấp (T = 8 °C)
II	12MOB098LM	12MOB118LM	12MOB098LM
II	12MOB118LM	12MOB098LM	12MOB079LM
IV	12MOB096LM	12MOB097LM	12MOB096LM
IV	12MOB106LM	12MOB096LM	12MOB105LM
Nguồn gốc	Các sản phẩm khác
Kiểu huyết thanh	Giá trị a_wthấp (a_w= 0,95)	Độ pH thấp (pH = 5)	Nhiệt độ thấp (T = 8 °C)
II	12MOB048LM	12MOB051LM	12MOB049LM
II	12MOB047LM	12MOB047LM	12MOB047LM/ 12MOB051LM
IV	12MOB050LM	12MOB050LM	12MOB052LM
IV	12MOB052LM	12MOB052LM	12MOB050LM
Ghi chú cách sử dụng: – Bước 1: Chọn nhóm sản phẩm: có thịt, sữa và các sản phẩm khác; – Bước 2: Chọn kiểu huyết thanh của Lm; – Bước 3: Chọn yếu tố kiểm soát, có ba yếu tố kiểm soát để chọn chủng, nếu sản phẩm có a_w thấp thì chọn chủng Lm theo cột a_w, nếu sản phẩm có pH thấp hoặc axit cao (pH ≤ 5) thì chọn chủng Lm theo cột pH, nếu sản phẩm không có a_w thấp và không có pH thấp thì chọn cột nhiệt độ thấp. Ví dụ: – Ví dụ 1: nếu sản phẩm cần kiểm tra đến từ các sản phẩm sữa, có tính axit cao (pH ≤ 5), thì chủng được chọn có thể là 12MOB118LM hoặc 12MOB098LM hoặc 12MOB097LM hoặc 12MOB096LM. – Ví dụ 2: nếu sản phẩm cần kiểm tra đến từ các sản phẩm thịt, không có tính axit (pH > 5), cũng không có hệ số a_wthấp (a_w> 0,95), thì chủng được chọn có thể là 12MOB045LM hoặc 12MOB046LM hoặc 12MOB085LM hoặc 12MOB089LM.

Tốc độ sinh trưởng của các chủng Lm thay đổi tùy thuộc vào loại thực phẩm và điều kiện bảo quản được nghiên cứu. Để giúp phòng thí nghiệm tìm kiếm và lựa chọn các chủng Lm phù hợp, tổ chức nên tham chiếu các hướng dẫn của Phòng thí nghiệm tham chiếu của Liên minh Châu Âu (EURL) về vi khuẩn Lm đã thiết lập một bộ các chủng Lm được phân lập từ các nguồn gốc khác nhau (thịt, cá, sản phẩm sữa và môi trường). Các chủng này đã được đặc trưng về khả năng sinh trưởng (tốc độ sinh trưởng tối đa µ_max đã được xác định trong điều kiện pH, độ ẩm và nhiệt độ khắc nghiệt), xem bảng 9.3.

Các chủng vi khuẩn Lm của EURL được phân loại theo tốc độ sinh trưởng liên quan đến nguồn gốc, điều kiện nhiệt độ, độ pH và độ ẩm, cũng như kiểu gen. Thông tin chi tiết hơn được mô tả trong báo cáo dành riêng cho các chủng được sử dụng trong thử nghiệm thử thách, có sẵn tại https://eurl – listeria.anses.fr/.

3.2.4.2. Chuẩn bị hỗn hợp cấy

Việc chuẩn hóa quy trình chuẩn bị vật cấy vi sinh đặc biệt quan trọng để có thể cấy vi sinh vào thực phẩm ăn liền ở nồng độ mong muốn là 100 cfu/g hoặc ml (khoảng từ 50 đến 200 cfu/g).

Để sẵn sàng cấy giống vào lô hàng ngay trong ngày nhận tại phòng thí nghiệm, cần tiến hành cấy chuyền để chuẩn bị dịch cấy trước. Tổng thể tích dịch cấy đã chuẩn bị phải đủ lớn để cấy cho tất cả các mẫu thử.

Hoạt hóa từng chủng riêng lẻ;
Nuôi cấy đến pha cuối log/đầu cân bằng;
Chuẩn hóa mật độ;
Trộn các chủng với tỷ lệ bằng nhau;
Pha loãng để đạt nồng độ mục tiêu.

3.2.4.3. Mức cấy ban đầu

Khuyến nghị:

Nồng độ vi sinh vật: 50 – 200 CFU/g.
Không vượt quá 1.000 CFU/g.

Mục tiêu:

Mô phỏng nhiễm thực tế.
Không gây áp lực sinh thái không thực tế.

3.2.4.4. Lựa chọn kịch bản và số lượng mẫu

Số lượng mẫu lấy nên tham khảo tiêu chuẩn EN ISO 20976-1 như Bảng 9.4.

Bảng 9.4. Số lượng mẫu lấy cần thiết theo ISO 20976‑1:2019
Thông số	Tiềm năng tăng trưởng – Δ (Growth potential)	Tốc độ tăng trưởng – μ (Growth rate)
Số lô (batch) tối thiểu	3 lô *	3 lô*
Số đơn vị mẫu thử tối thiểu trên mỗi lô	1 đơn vị mẫu *	1 đơn vị mẫu
Số điểm lấy mẫu tối thiểu	5 điểm lấy mẫu (bao gồm t₀ và t_cuối)	8 điểm lấy mẫu (bao gồm 5 điểm trong pha logarit/pha lũy thừa)
Tổng số đơn vị mẫu thử tối thiểu	3 lô x 1 mẫu x 5 điểm lấy mẫu = 15 đơn vị mẫu	3 lô x 1 mẫu x 8 điểm lấy mẫu = 24 đơn vị mẫu
Số đơn vị mẫu kiểm chứng (control) tối thiểu	3 lô x 1 mẫu kiểm chứng x 2 điểm (t₀ và t_cuối) (+ kiểm soát nhiệt độ**) = 6 đơn vị mẫu	3 lô x 1 mẫu kiểm chứng x 2 điểm (t₀ và t_cuối) (+ kiểm soát nhiệt độ**) = 6 đơn vị mẫu.
Tổng số đơn vị mẫu tối thiểu	21 đơn vị	30 đơn vị
Ghi chú: () Việc sử dụng một lô duy nhất phải được giải thích rõ ràng, ví dụ: để đánh giá một công thức sản phẩm mới hoặc sử dụng một lô đại diện cho các điều kiện tăng trưởng thuận lợi nhất (trường hợp xấu nhất). Trong trường hợp đó, số lượng đơn vị mẫu thử trên mỗi lô được tăng lên thành 3. (*) Nếu ba lô không được thực hiện cùng một lúc, cần ít nhất một thiết bị kiểm soát nhiệt độ cho mỗi lô.

Chọn thời điểm mà việc kiểm soát sản xuất có kịch bản xấu nhất (ví dụ như các chỉ số kiểm soát quá trình hoặc các chỉ tiêu kỹ thuật của sản phẩm tiệm cận ngưỡng cho phép).

Sau đây là các ví dụ về tổng số đơn vị cần thiết cho một bài thử nghiệm đánh giá năng lực phát triển.

Đối với sản phẩm kín và hút chân không xem ví dụ ở Bảng 9.5, đối với sản phẩm đóng gói theo MAP xem ví dụ ở Bảng 9.6, đối với sản phẩm được đóng gói trong không khí hoặc hút chân không xem ví dụ ở Bảng 9.7, đối với sản phẩm được đóng gói trong không khí hoặc hút chân không xem ví dụ ở Bảng 9.8 bên dưới.

Bảng 9.5. Ví dụ 1 – Sản phẩm được đóng gói trong không khí hoặc hút chân không – Phân tích 3 lô hàng

Loại đơn vị	Loại phân tích	Số lượng đơn vị và ngày phân tích cho mỗi lô
Đơn vị thử nghiệm	Định lượng vi khuẩn Lm	7	3 đơn vị thử nghiệm tại thời điểm bắt đầu (t₀) và 1 bài thử nghiệm vào 3 thời điểm trung gian và 1 bài kiểm tra vào cuối kỳ (t_cuối).
Mẫu kiểm soát thực phẩm	Phát hiện Lm	1	1 tại t₀.
	Đo lường các đặc tính lý hóa
	Liệt kê các vi sinh vật liên quan
Kiểm soát mẫu	Đo lường các đặc tính lý hóa	2	1 tại t₀và 1 tại t_cuối
	Liệt kê các vi sinh vật liên quan
	Kiểm soát nhiệt độ	1	suốt cả bài kiểm tra
Tổng số đơn vị		11 *
Tổng số lượng cần thiết cho 3 lô hàng		33 *

(*) Tùy thuộc vào lượng sản phẩm trong mỗi đơn vị, tổng số lượng này có thể cần phải tăng lên để có đủ lượng sản phẩm thực hiện tất cả các phân tích cần thiết.

Bảng 9.6. Ví dụ 2 – Sản phẩm đóng gói theo MAP – Phân tích 3 lô hàng

Loại đơn vị	Loại phân tích	Số lượng đơn vị và ngày phân tích cho mỗi lô
Đơn vị thử nghiệm	Định lượng vi khuẩn Lm	7	3 đơn vị thử nghiệm tại thời điểm t₀và 3 chất trung gian và 1 ở t_cuối
Mẫu kiểm soát thực phẩm	Phát hiện Lm	2	1 tại t₀
	Đo lường các đặc tính lý hóa		1 tại t₀
	Liệt kê các vi sinh vật liên quan		1 tại t₀
	Đo lường MAP		1 tại t₀và 1 tại t_cuối
Kiểm soát mẫu	Đo lường các đặc tính lý hóa	2	1 tại t₀và 1 tại t_cuối
	Liệt kê các vi sinh vật liên quan
	Đo lường MAP
	Kiểm soát nhiệt độ	1	suốt cả bài kiểm tra
Tổng số lượng cần thiết cho mỗi lô hàng		12*
Tổng số lượng cần thiết cho 3 lô hàng		36*

Bảng 9.7. Ví dụ 3 – Sản phẩm được đóng gói trong không khí hoặc hút chân không – Phân tích 3 lô – Đo các thông số lý hóa được thực hiện bên ngoài.

Loại đơn vị	Loại phân tích	Số lượng đơn vị và ngày phân tích cho mỗi lô
Đơn vị thử nghiệm	Đếm số lượng vi khuẩn Lm	7	3 đơn vị thử nghiệm tại thời điểm t₀và 3 ở thời điểm giữ và 1 ở t_cuối
Mẫu kiểm soát thực phẩm	Phát hiện Lm	1	1 tại t₀
	Liệt kê các vi sinh vật liên quan		1 tại t₀
	Đo lường các đặc tính lý hóa	2 (thuê ngoài)	1 tại t₀và 1 tại t_cuối
Kiểm soát mẫu	Liệt kê các vi sinh vật liên quan	2	1 tại t₀và 1 tại t_cuối
	Đo lường các đặc tính lý hóa	2 (thuê ngoài)
	Kiểm soát nhiệt độ	1	Suốt thời gian thử nghiệm
Tổng số lượng cần thiết cho mỗi lô hàng		15*
Tổng số lượng cần thiết cho 3 lô hàng		45*

Bảng 9.8. Ví dụ 4 – Sản phẩm được đóng gói trong không khí hoặc hút chân không – 3 lô được phân tích – 3 đơn vị thử nghiệm được phân tích cho mỗi điểm lấy mẫu

Loại đơn vị	Loại phân tích	Số lượng đơn vị và ngày phân tích cho mỗi lô
Đơn vị thử nghiệm	Định lượng vi khuẩn Lm	15	3 đơn vị thử nghiệm cho mỗi trong 5 điểm lấy mẫu.
Mẫu kiểm soát thực phẩm	Phát hiện Lm	3	1 tại t₀
	Đo lường các đặc tính lý hóa		3 tại t₀
	Liệt kê các vi sinh vật liên quan		3 tại t₀
Kiểm soát mẫu	Đo lường các đặc tính lý hóa	3	3 tại t₀và t_cuối
	Liệt kê các vi sinh vật liên quan	3	3 tại t₀và t_cuối
	Kiểm soát nhiệt độ	1	Suốt thời gian thử nghiệm
Tổng số lượng cần thiết cho mỗi lô hàng		22*
Tổng số lượng cần thiết cho 3 lô hàng		66*

3.2.5. Quy trình thực hiện

3.2.5.1. Cấy nhiễm

Thời điểm thực hiện việc cấy mẫu nên tiến hành trong vòng 2 ngày sau khi sản xuất. Nếu thực hiện muộn hơn (do vận chuyển hoặc sản phẩm có hạn dùng dài), phải chứng minh sự chậm trễ này không làm thay đổi cấu trúc, lý hóa và hệ vi sinh vật của thực phẩm.

Yêu cầu về độ đồng đều Vi khuẩn Lm phải được phân bố đồng đều. Độ lệch chuẩn của số lượng Lm tại ngày 0 (từ 3 lần lặp lại) phải dưới 0,3 log cfu/g. Nếu cao hơn, kết quả thử nghiệm trên lô đó không được chấp nhận.

Kỹ thuật cấy vi sinh Có thể áp dụng các kỹ thuật sau tùy loại thực phẩm:

Mở bao bì để cấy: Sau đó đóng gói lại trong điều kiện khí quyển tương tự ban đầu.
- Cấy trộn: Áp dụng cho thực phẩm đồng nhất hoặc hỗn hợp (salad).
- Cấy bề mặt: Mô phỏng nhiễm bẩn trong quá trình cắt lát.
- Cấy đa thành phần: Cấy vào các lớp hoặc bề mặt tiếp xúc giữa các thành phần (như sản phẩm sandwich).
Cấy qua màng ngăn: Thực hiện trực tiếp qua bao bì gốc và niêm phong lại để giữ nguyên điều kiện khí.

Kiểm soát quá trình:

Có thể được sử dụng các kỹ thuật khác nhau để gây nhiễm nếu chứng minh được rằng hàm lượng độ ẩm không thay đổi và sẽ không ảnh hưởng đến các đặc tính vốn có của thực phẩm (ví dụ: nhúng).
Cần sử dụng thuốc nhuộm pha loãng để kiểm tra độ phân tán trước khi cấy vi khuẩn thật.
Đảm bảo thể tích không gian trống và thành phần khí sau khi đóng gói lại phải mô phỏng càng giống với sản phẩm thương mại càng tốt.

Mức độ nhiễm bẩn

Mức tiêu chuẩn: Khoảng 100 cfu/g (dao động từ 50 – 200 cfu/g) để giảm sai số đo lường.
Trường hợp đặc biệt: Đối với sản phẩm lên men, có thể dùng mức nhiễm cao hơn để dễ dàng theo dõi Lm giữa các quần thể vi sinh vật khác.

Lưu ý: quá trình cấy nhiễm phải đảm bảo:

Cấy đều trên bề mặt hoặc trộn đồng nhất (tùy sản phẩm).
Không làm thay đổi đáng kể pH, a_w.
Ghi nhận chính xác lượng cấy.

Một số ví dụ về kỹ thuật gây nhiễm: Các mẫu thử có thể bị nhiễm bẩn ở sâu bên trong hoặc trên bề mặt.

Sản phẩm dạng bán lỏng số lượng nhỏ: sản phẩm bán lỏng với số lượng nhỏ (20 g) trong túi vô trùng, ví dụ 20 g kem trứng lây nhiễm bằng một lượng nhỏ được lấy bằng pipet xem hình 9.3.

Hình 9.3. Gây nhiễm sản phẩm dạng lỏng số lượng nhỏ

Sản phẩm bán lỏng với số lượng lớn: một sản phẩm bán lỏng với số lượng lớn (≈500 g) được xay bằng máy xay sinh tố, sau đó chia thành x mẫu có khối lượng x g, việc lây nhiễm từng phần như ví dụ kem trứng lượng nhỏ bằng pipet.

Hình 9.4. Gây nhiễm sản phẩm dạng lỏng số lượng lớn

Sản phẩm dạng lát: Sản phẩm được cắt lát, ví dụ như một lát cá hồi hun khói, việc lây nhiễm bằng cách chấm 5 chấm lên bề mặt, mỗi chấm 20 µl trên một nửa bề mặt đĩa, sau đó đĩa được gập lại. Sử dụng một dụng cụ trải đều để làm đều sự phân bố của dung dịch nhiễm Lm (xem hình 9.5).

Hình 9.5. Sản phẩm lây nhiễm dạng thái lát

Sản phẩm rắn dạng mảnh, sợi nhỏ: Sản phẩm rắn gồm các mảnh nhỏ, ví dụ như thịt giăm bông xé nhỏ, việc lây nhiễm Lm trên bề mặt các mảnh bằng ống tiêm có vạch chia độ thông qua một màng chắn. Màng chắn này được đậy kín ngay lập tức bằng một màng chắn thứ hai để không làm phá vỡ môi trường bao bì và duy trì điều kiện khí chính xác (xem hình 9.6).

Lưu ý: Có thể chia lượng mẫu cấy thành 2 phần và phân phối qua 2 vách ngăn. Có thể chia lượng mẫu cấy thành nhiều phần hơn và phân phối qua nhiều vách ngăn hơn. Sau khi cấy, các mẫu thử được lắc mạnh để phân phối lượng mẫu cấy đồng đều.

Hình 9.6. Sản phẩm lây nhiễm dạng thái lát

3.2.5.2. Đóng gói

Theo đúng bao bì thương mại.
Nếu MAP: phải thiết lặp lại thành phần khí.

3.2.5.3. Bảo quản thử nghiệm

Điều kiện bảo quản khi ủ mẫu phải mô phỏng sát thực tế chuỗi cung ứng lạnh mà sản phẩm trải qua, từ sản xuất, bán lẻ đến tay người tiêu dùng. Việc sử dụng nhiệt độ thấp hơn thực tế có thể dẫn đến đánh giá sai lệch, làm thấp đi khả năng phát triển của Lm và kéo dài thời hạn sử dụng an toàn một cách ảo.

Tổ chức phải chứng minh và ghi chép đầy đủ các thông số nhiệt độ/thời gian ủ mẫu. Các thông số này không chỉ dựa trên nhiệt độ ghi trên bao bì mà phải tính đến sự biến động nhiệt thực tế trong quá trình phân phối.

Xác định nhiệt độ bảo quản theo các giai đoạn:

Giai đoạn 1 (Sản xuất đến bán lẻ): Ưu tiên sử dụng dữ liệu thực tế được tổ chức thu thập. Nếu thiếu dữ liệu, tổ chức có thể dùng nhiệt độ theo hướng dẫn (Bảng 9.8).
Giai đoạn 2 & 3 (Tại điểm bán lẻ và người tiêu dùng): Ưu tiên sử dụng dữ liệu quốc gia tại nơi sản phẩm được tiêu thụ. Trường hợp không có thông tin chính thức, tổ chức có thể dùng nhiệt độ theo hướng dẫn (Bảng 9.9).

Điều kiện phải phản ánh:

Nhiệt độ ghi nhãn;
Nhiệt độ cao hơn hợp lý có thể xảy ra;
Biến thiên trong phân phối.

Bảng 9.9. Sơ đồ quy trình điều kiện bảo quản trong toàn bộ chuỗi cung ứng lạnh
Các giai đoạn	Nhiệt độ bảo quản (ủ mẫu)	Thời gian bảo quản (ủ mẫu)
Tại cấp độ nhà sản xuất	Nhiệt độ được chứng minh bằng thông tin chi tiết *; Hoặc nếu không biết: 7 °C.	Thời gian được chứng minh bằng thông tin chi tiết; Nếu không biết thì: – 1/3 Hạn sử dụng đối với sản phẩm ≤ 21 ngày. – 7 ngày đối với sản phẩm > 21 ngày.
Tại cấp độ bán lẻ	Nhiệt độ được chứng minh bằng thông tin chi tiết **; Hoặc nếu không biết: 7 °C.	Thời gian được chứng minh bằng thông tin chi tiết; Nếu không biết thì: – 1/3 hạn sử dụng cho sản phẩm ≤ 21 ngày. – 1/2 (hạn sử dụng – 7 ngày) cho sản phẩm > 21 ngày.
Tại cấp độ người tiêu dùng	Nhiệt độ được chứng minh bằng thông tin chi tiết **; Hoặc nếu không biết: 10 °C.	Thời gian được chứng minh bằng thông tin chi tiết; Nếu không biết thì: – 1/3 hạn sử dụng cho sản phẩm ≤ 21 ngày. – 1/2 (hạn sử dụng – 7 ngày) cho sản phẩm > 21 ngày.

Ghi chú:

* Nhiệt độ được xác thực bằng thông tin chi tiết: phân vị thứ 95 của dữ liệu quan sát từ tổ chức.
** Nhiệt độ được xác định dựa trên thông tin chi tiết: phân vị thứ 95 của các quan sát đối với quốc gia nơi đặt điểm cuối của chuỗi cung ứng lạnh.
Phân vị thứ 95 (95^th percentile) là giá trị mà tại đó có 95 % các điểm dữ liệu trong tập hợp thấp hơn hoặc bằng nó, và chỉ có 5 % các điểm dữ liệu cao hơn nó.

Ví dụ về tác động của nhiệt độ bảo quản đến thời hạn sử dụng

Nhiệt độ trong suốt thời gian bảo quản là một phần quan trọng của thử nghiệm đánh giá khả năng phát triển của vi sinh vật. Điều này được minh họa bên dưới trên một sản phẩm thịt được bảo quản ở các nhiệt độ khác nhau:

Tình huống #1: ở nhiệt độ không đổi 4 °C.
Kịch bản #2: bao gồm 3 bước (mỗi bước bằng một phần ba thời hạn sử dụng).
(i) 4 °C để mô phỏng quá trình bảo quản/vận chuyển từ nhà máy đến cửa hàng bán lẻ.
(ii) 7 °C để mô phỏng quá trình bảo quản tại cửa hàng bán lẻ và.
(iii) 10 °C để mô phỏng quá trình bảo quản tại người tiêu dùng.
Kịch bản #3: bao gồm 3 bước (mỗi bước bằng một phần ba thời hạn sử dụng):
(i) 7 °C để mô phỏng quá trình bảo quản/vận chuyển từ nhà máy đến cửa hàng bán lẻ.
(ii) 7 °C để mô phỏng quá trình bảo quản tại cửa hàng bán lẻ và.
(iii) 10 °C để mô phỏng quá trình bảo quản tại người tiêu dùng.
Thời hạn sử dụng của sản phẩm: 30 ngày.
Đặc tính lý hóa của sản phẩm: pH = 6,1 và a_w = 0,978.
Bao bì sản phẩm: 50 % CO₂ / 50 % N₂ .
Phần lây nhiễm: 100g.
Mức độ nhiễm khuẩn ban đầu trung bình của Lm trong sản phẩm này: -2 log₁₀ cfu/g.
Thời hạn sử dụng của sản phẩm được ước tính cho từng trường hợp (Hình 9.7).

Hình 9.7. Thời hạn sử dụng của sản phẩm thịt liên quan đến

các tình huống khác nhau

Thời hạn sử dụng của sản phẩm là 30 ngày trong trường hợp #1. Thời hạn sử dụng thu được trong trường hợp #2 và #3 lần lượt ngắn hơn 1,4 và 3 lần.

3.2.5.6. Kế hoạch và phương pháp lấy mẫu

Thời điểm phân tích tối thiểu:
t₀: Ngay sau cấy;
Giữa hạn sử dụng;
t_cuối: Cuối hạn sử dụng;
Có thể thêm các điểm trung gian.

Thời gian lấy mẫu phân tích thể hiện trong Bảng 9.8 ở trên. Ví dụ sử dụng bảng 9.8 như sau:

Trường hợp sản phẩm có hạn sử dụng dài (trên 21 ngày), giả định rằng sản phẩm sẽ mất 7 ngày đầu tiên nằm ở giai đoạn sản xuất và vận chuyển, do đó ghi là 7 ngày. Phần thời gian còn lại của hạn sử dụng sẽ là: hạn sử dụng – 7 ngày. Công thức: 1/2 (hạn sử dụng – 7) dùng để chia đều phần thời gian còn lại đó cho hai giai đoạn tiếp theo, trong đó:
Giai đoạn bán lẻ (Retail level): Chiếm một nửa thời gian còn lại.
Giai đoạn người tiêu dùng (Consumer level): Chiếm một nửa thời gian còn lại.
Giả sử có một sản phẩm thực phẩm ăn liền có hạn sử dụng (HSD) là 30 ngày. Vì 30 > 21 ngày, chúng ta áp dụng cột bên phải của bảng:

Bảng 9.10 Ví dụ về cách tính thời gian ủ mẫu có hạn sử dụng 30 ngày

Giai đoạn	Cách tính thời gian ủ mẫu
Tại nhà sản xuất	Mặc định là 7 ngày
Tại điểm bán lẻ	1/2 (HSD – 7) = 1/2 x (30 – 7) = 11,5 ngày
Tại người tiêu dùng	1/2 (HSD – 7) = 1/2 x (30 – 7) = 11,5 ngày
Tổng cộng	7 + 11,5 + 11,5 = 30

Bảng 9.11. Ví dụ về cách tính thời gian ủ mẫu có hạn sử dụng 18 ngày

Giai đoạn	Cách tính thời gian ủ mẫu
Tại nhà sản xuất	1/3 HSD = 1/3 x 18 = 6 ngày
Tại điểm bán lẻ	1/3 HSD = 1/3 x 18 = 6 ngày
Tại người tiêu dùng	1/3 HSD = 1/3 x 18 = 6 ngày
Tổng cộng	6 + 6 + 6 = 18 ngày.

Lấy mẫu ngẫu nhiên đơn lẻ

Phương pháp lấy mẫu ngẫu nhiên đơn lẻ dựa trên nguyên tắc xác suất bằng nhau. Nguyên tắc này đảm bảo tất cả các đơn vị thử nghiệm trong lô đều có cùng cơ hội được chọn. Để thỏa mãn nguyên tắc này, kích thước của lô (N) phải đủ lớn so với số lượng (n) đơn vị thử nghiệm: n/N < 10 %.

Một cách để thực hiện lấy mẫu ngẫu nhiên đơn giản là đánh số từng đơn vị trong lô hàng hoặc theo cách thực tế hơn là “thời gian sản xuất”, sau đó sử dụng các số ngẫu nhiên để chọn số lượng đơn vị thử nghiệm cần thiết. Ví dụ, có thể lấy các số ngẫu nhiên bằng phần mềm Excel với hàm =RAND(), hoặc từ các bảng số ngẫu nhiên.

Các số ngẫu nhiên này sau đó được phân loại theo thứ tự tăng dần và mười số đầu tiên được chọn. Việc lấy mẫu được thực hiện bằng cách chọn ra mười đơn vị vào những thời điểm đã chọn, ở cuối dây chuyền sản xuất.

3.2.5.7. Phương pháp phân tích

3.2.5.7.1. Phương pháp phân tích chỉ tiêu hoá lý

Mục đích việc phân tích các chỉ tiêu hoá lý là để xác định xem liệu quá trình thử nghiệm của tổ chức có ở những kịch bản xuất nhất của sản phẩm mà điều kiện sản xuất có thể tạo ra. Điều kiện này liệu có phù hợp cho việc phát triển của Lm trong suốt quá trình bảo quản. Các chỉ tiêu hoá lý này thông thường là pH, a_w, nồng độ NaCL, các axit hữu cơ, các chất bảo quản,…

Đối với các sản phẩm có NaCl và độ ẩm, có thể tính hoạt độ nước thông qua các yếu tố này thông qua công thức của Resnik và Chirife (1988) như sau:

Tính hàm lượng muối pha trong nước (WPS) theo công thức:

WPS =	hàm lượng muối (g/100 g)	x 100
	hàm lượng muối (trong 100g) x độ ẩm (trong 100g)

Tính hoạt độ nước a_w như sau:

a_w = 1 – 0.0052471 𝑥 𝑊𝑃𝑆 − 0.00012206 𝑥 𝑊𝑃𝑆²

Hoặc có thể sử dụng công cụ tính toán sẵn có trên phần mềm FSSP (Food Safety and Spoilage Predictor) theo đường link: http://fssp.food.dtu.dk/

Để đo lường các đặc tính lý hóa của sản phẩm, nên ưu tiên sử dụng các phương pháp tiêu chuẩn hóa (ví dụ: ISO, EN hoặc tiêu chuẩn quốc gia). Các phép đo này cần được so sánh với dữ liệu thu được từ quá trình sản xuất thực phẩm thông thường để chứng minh rằng các lô sản phẩm được sử dụng trong thử nghiệm thử thách là đại diện cho quy trình sản xuất bình thường và, tốt hơn hết, lô sản phẩm được sử dụng trong thử nghiệm thử thách đại diện cho trường hợp xấu nhất.

Khi đo các tính chất lý hóa của một sản phẩm, cần phải thử nghiệm một phần đại diện của sản phẩm đó, có tính đến vị trí dự kiến có mặt của Lm trong sản phẩm. Dưới đây là một số ví dụ để minh họa điều này:

Thức ăn nhiều thành phần (sản phẩm hỗn hợp): Cần xác định thành phần có điều kiện xấu nhất và sử dụng nó để thử nghiệm thêm khi các thành phần khác nhau được tách biệt trong bao bì thực phẩm và không tương tác với nhau. Khi các thành phần riêng biệt có khả năng tương tác với nhau, sự phát triển của Lm sẽ bị ảnh hưởng bởi môi trường vi mô, và điều này cần được tính đến.
Cá hun khói: Lm thường hiện diện trên bề mặt sản phẩm hơn là bên trong. Do đó, đặc tính hóa học của bề mặt sản phẩm đặc biệt quan trọng. Những đặc tính này có thể khác với phần bên trong sản phẩm.
Trong trường hợp sản phẩm có hoạt độ nước a_w ≤ 0,9, dữ liệu của nhà sản xuất cho thấy rằng phân bố hoạt độ nước là 0,88 ± 0,015. Vậy điều kiện thực nghiệm ở kịch bản xuất nhất là a_{w =} 0,895 hoặc là a_{w =} 0,9.

Yếu tố môi trường khí

Đối với các mẫu thử được đóng gói lại và điều kiện chân không, điều quan trọng là phải đảm bảo máy hút chân không hoạt động hiệu quả để đạt được điều kiện chân không ban đầu tương tự.

Đối với các mẫu thử được đóng gói lại, ban đầu được bảo quản trong môi trường khí biến đổi, điều quan trọng là phải sử dụng cùng các điều kiện đóng gói trong môi trường khí biến đổi (MAP): thành phần khí, tỷ lệ khí/sản phẩm và độ thấm khí của vật liệu đóng gói (các đặc tính rào cản tương tự).

Đối với các mẫu thử được đóng gói trong môi trường khí được điều chỉnh và được cấy vi sinh vật qua màng chắn trong bao bì gốc, điều quan trọng là phải kiểm tra độ kín của bao bì trong suốt thời gian thử nghiệm. Do đó, thành phần khí nên được đo bằng máy phân tích khí trong không gian đầu bao bì để đảm bảo không có rò rỉ nào xảy ra trong bao bì trong suốt thời gian bảo quản.

Các phân tích này nên được thực hiện trên mẫu kiểm soát thực phẩm vào đầu thử nghiệm (t₀) và cuối thử nghiệm (t_cuối) trên mẫu kiểm soát thực phẩm (không có màng chắn) và trên đơn vị kiểm soát (có màng chắn) để kiểm tra độ kín của bao bì trong suốt thời gian thử nghiệm.

Yếu tố nhiệt độ

Nhiệt độ bảo quản của các mẫu thử sẽ được ghi lại trong suốt quá trình thử nghiệm bằng thiết bị ghi dữ liệu nhiệt trong một thiết bị thử nghiệm đối chứng chuyên dụng, đặt trong cùng một tủ ấm và càng gần các mẫu thử còn lại càng tốt.

3.2.5.7.2. Phương pháp phân tích chỉ tiêu vi sinh

Định lượng theo: ISO 11290-1 và ISO 11290-2.

Đối với phân tích định lượng Lm, vì mức độ ô nhiễm mục tiêu là khoảng 100 cfu/g (phạm vi từ 50-200 cfu/g), nên khuyến nghị thực hiện như sau:

Hạ giới hạn đếm xuống còn 10 cfu/g, theo tiêu chuẩn ISO 11290-2 bằng cách:
Sử dụng 1 ml dung dịch huyền phù ban đầu, trải đều lên 3 đĩa có đường kính Ø 90 mm, hoặc trải đều lên 1 đĩa lớn có đường kính Ø 140 mm.
Hoặc, đối với các phương pháp thay thế đã được kiểm chứng, đổ 1ml vào 1 đĩa có đường kính Ø 90 mm.
Áp dụng phương pháp đếm có mức phát hiện thấp hơn tiêu chuẩn ISO 11290-2, với điều kiện phương pháp đó đã được thẩm định và chứng minh là phù hợp để đếm ở mức độ thấp như vậy với độ chính xác đủ.

Tính đến mức độ nuôi cấy (mục tiêu trong khoảng 50 – 200 cfu/g), để tránh gặp phải tình trạng số lượng khuẩn lạc thấp (ít hơn 10 khuẩn lạc trên một đĩa Petri, theo tiêu chuẩn ISO 7218) khi đếm khuẩn lạc, có thể thực hiện các cách sau:

Hoặc giảm hệ số pha loãng của huyền phù ban đầu (ví dụ: 1/5 thay vì 1/10);
Hoặc tăng thể tích huyền phù được trải trên các đĩa (ví dụ: 2 ml trên 2 đĩa đường kính 140 mm hoặc 2 ml trên 6 đĩa đường kính 90 mm).

Hệ vi sinh vật nền cần được xem xét bao gồm tổng số vi sinh vật hiếu khí ưa trung nhiệt (ISO 4833) hoặc hệ vi sinh vật đặc thù của thực phẩm (ví dụ: vi khuẩn lactic, Pseudomonas spp, nấm men, nấm mốc). Các phương pháp được sử dụng để định lượng các hệ vi sinh vật đặc thù này phải tuân theo các tiêu chuẩn ISO hoặc tiêu chuẩn quốc gia có liên quan đối với sinh vật và loại thực phẩm được đề cập.

3.2.5.8. Tính toán tiềm năng tăng trưởng (Δ)

Tính cho từng lô: Δ = log_max – log_i

Giá trị Δ_max cuối cùng = giá trị Δ lớn nhất quan sát được.

Khi phân tích nhiều hơn một mẫu thử tại mỗi điểm lấy mẫu, thì log _maxlà giá trị trung bình cao nhất thu được từ mỗi trong 4 điểm lấy mẫu này. Log_ilà giá trị trung bình của 3 mẫu thử được phân tích tại thời điểm t₀.

3.2.5.9. Tiêu chí đánh giá

Kết luận:

Nếu Δ_max ≤ 0.5 log –> Sản phẩm không hỗ trợ tăng trưởng Lm.
Nếu Δ_max > 0.5 log –> Sản phẩm hỗ trợ tăng trưởng Lm.

Nếu Δ_max > 0.5 log → sản phẩm thuộc nhóm “hỗ trợ tăng trưởng Lm”.

3.2.5.10. Phân tích thống kê

Tính trung bình và SD.
Đánh giá độ lặp lại giữa các lô.
Xem xét sự khác biệt dữ liệu (outlier) hợp lý.

3.2.5.11. Đánh giá điều kiện xấu nhất

Phải chứng minh:

Chủng chọn là đại diện đặc cho sản phẩm.
Nhiệt độ là worst-case hợp lý.
Hạn sử dụng dài nhất.
Sai số thiết bị đo được xem xét.

3.2.5.12. Báo cáo kết quả

Báo cáo phải gồm:

Mô tả sản phẩm;
Lý do thực hiện;
Thiết kế thử nghiệm;
Điều kiện bảo quản;
Kết quả định lượng;
Tính toán Δ;
Đánh giá;
Kết luận phân loại sản phẩm.

3.2.5.13. Diễn giải kết quả trong bối cảnh pháp lý

Nếu:

Δ_max ≤ 0.5 log → có thể áp dụng tiêu chí 100 CFU/g;
Δ_max > 0.5 log → phải đảm bảo “không có Lm trong 25g” trước khi rời cơ sở sản xuất.

3.2.5.14. Sai sót thường gặp

Cấy nồng độ quá cao;
Không tái lập MAP đúng;
Không tính đến biến thiên nhiệt độ;
Chỉ lấy mẫu đầu và cuối;
Không thực hiện trên nhiều lô.

3.2.6. Ví dụ thực tế

Dưới đây là ví dụ thực hiện thử nghiệm thử thách cho sản phẩm cá hồi cắt hạt lựu.

3.2.6.1. Mục đích và đối tượng áp dụng.

Mục đích: Xác định tốc độ sinh trưởng tối đa (V_max) của Lm để đánh giá khả năng hỗ trợ tăng trưởng và thiết lập thời hạn sử dụng.

Đối tượng: Sản phẩm cá hồi cắt hạt lựu (1 cm²), đóng gói trong môi trường không khí, hạn sử dụng 5 ngày (120 giờ) ở 0 – 2 ^oC. Sản phẩm có pH = 6,2 và a_w = 0,99, thuộc nhóm hỗ trợ tăng trưởng vi khuẩn.

3.2.6.2. Thiết kế thử nghiệm và lựa chọn chủng

Lựa chọn chủng: Sử dụng chủng 12MOB099LM (Genoserotype II). Đây là chủng nằm trong danh mục hướng dẫn của EURL như Bảng 9.12.

Bảng 9.12. Thông số chọn chủng Lm
Thông số	Chi tiết thực hiện
Chủng vi khuẩn chọn	L. monocytogenes 12MOB099LM (Genoserotype II) được phân lập từ hải sản.
Lý do chọn	Phân lập từ hải sản, thuộc bộ chủng chuẩn của EURL Lm
Môi trường nuôi cấy	Brain Heart Infusion (BHI) broth
Thích nghi lạnh	Ủ ở 10 ⁰C trong 3 ngày trước khi cấy để thích nghi điều kiện tủ lạnh
Nồng độ mục tiêu	Khoảng 2 log₁₀ CFU/g

Số lượng mẫu: Thực hiện trên 3 lô độc lập như bảng 9.13.

Bảng 9.13. Số lô cần thiết thử nghiệm

Loại đơn vị mẫu	Số lượng mẫu/Lô	Mục đích phân tích
Đơn vị thử nghiệm	10 mẫu	Định lượng vi khuẩn Lm tại các thời điểm để lập đường cong sinh trưởng.
Mẫu kiểm soát thực phẩm	01 mẫu	Kiểm tra sự vắng mặt tự nhiên của Lm trước khi thử nghiệm.
Đơn vị đối chứng	01 mẫu	Phân tích hệ vi sinh vật nền và chỉ tiêu hóa lý (pH, a_w).
Đơn vị kiểm soát nhiệt độ	01 mẫu	Đặt thiết bị ghi dữ liệu nhiệt độ (Data logger) liên tục.
Tổng cộng (3 lô)	39 mẫu	Tổng số đơn vị sản phẩm cần chuẩn bị cho toàn bộ thử nghiệm.

Tính toán các giai đoạn thử nghiệm.

Bảng 9.14. Tính toán mốc thời gian ủ
Mốc thời gian	Các giai đoạn bảo quản	Nhiệt độ ủ	Cách tính thời gian (1/3 HSD)	Mốc thời gian cụ thể
t₀	Bắt đầu thử nghiệm
t₁	Tại nhà sản xuất	7 ⁰C	1/3 x 120 giờ	40 giờ (1,67 ngày)
t₂	Tại điểm bán lẻ	7 ⁰C	1/3 x 120 giờ	40 giờ (1,67 ngày)
t₃	Tại người tiêu dùng	10 ⁰C	1/3 x 120 giờ	40 giờ (1,67 ngày)
t₄	Hết hạn sử dụng
Tổng cộng		–	120 giờ	5 ngày

3.2.6.3. Chuẩn bị hỗn hợp cấy và cấy nhiễm

Chuẩn bị mẫu: Chủng được nuôi cấy trong môi trường BHI ở 37 ⁰C trong 24 giờ, sau đó được thích nghi trong điều kiện lạnh (10 ⁰C trong 3 ngày) trước khi cấy vào mẫu.

Chuẩn bị các dòng nuôi cấy phụ cho chủng cấp 1: Các bước nuôi cấy vi khuẩn Lm

Bước 1: Phục hồi chủng từ nguồn lưu trữ.
Sử dụng một hạt lưu mẫu đông lạnh (Cryobead) chứa chủng Lm thuần khiết.
Cho hạt lưu mẫu vào ống nghiệm chứa 9ml môi trường lỏng TSBYe (Tryptic Soy Broth + Yeast Extract) hoặc BHI (Brain Heart Infusion).
Bước 2: Nuôi cấy tăng sinh sơ cấp (Subculture 1)
Ủ mẫu ở nhiệt độ 30 °C hoặc 37 °C trong khoảng thời gian từ 8 đến 16 giờ.
Mục tiêu: Đưa vi khuẩn đạt đến pha cân bằng sớm (early stationary phase) với mật độ tế bào đạt khoảng 9.20 log₁₀cfu/ml.
Bước 3: Chuyển tiếp và pha loãng
Hút chính xác 0.1ml dịch nuôi cấy từ Bước 2 chuyển sang ống nghiệm chứa sẵn 9ml môi trường TSBYe hoặc BHI mới.
Bước 4: Nuôi cấy thích nghi nhiệt độ thấp (Subculture 2)
Tiến hành ủ trong điều kiện lạnh: 8 °C trong 4 ngày hoặc 10 °C trong 3 ngày.
Kết quả thu được là dịch nuôi cấy ở pha dừng sớm với mật độ tế bào ổn định tại 9.20 log₁₀cfu/ml.

Quy trình được lặp lại cho chủng 2 và các chủng khác nếu có sử dụng. Các giá trị được đưa ra là dành cho các chủng EURL Lm.

Chuẩn bị dịch nuôi cấy từ các lần cấy chuyển cấp 2

Quy trình này mô tả các bước từ việc phối trộn các chủng vi sinh vật riêng biệt cho đến khi tạo ra dịch chủng cuối cùng để thử nghiệm.

Bước 1: Chuẩn bị các chủng thứ cấp
Chuẩn bị riêng biệt các ống nghiệm chứa dịch cấy chuyển lần thứ hai của từng chủng vi sinh vật (chủng 1, chủng 2, …, chủng thứ n).
Đảm bảo các chủng này đang ở trạng thái phát triển tối ưu cho việc thử nghiệm.
Bước 2: Tạo hỗn hợp vi sinh vật
Tiến hành phối trộn các dịch cấy chuyển từ Bước 1 vào cùng một ống nghiệm lớn để tạo thành hỗn hợp vi sinh vật nuôi cấy.
Lưu ý quan trọng: Phải phối trộn mỗi chủng với nồng độ tương đương nhau để đảm bảo tính đồng nhất và đại diện của tất cả các chủng trong hỗn hợp cuối cùng.
Bước 3: Pha loãng kế tiếp
Thực hiện pha loãng hỗn hợp vi sinh vật bằng nước muối sinh lý.
Thực hiện các bước pha loãng nối tiếp nhau cho đến khi đạt được nồng độ vi sinh vật mục tiêu theo yêu cầu của phương pháp thử nghiệm.
Bước 4: Hoàn tất dịch nuôi cấy
Dịch sau khi pha loãng ở nồng độ mong muốn chính là dịch chủng sẵn sàng cho sử dụng.
Ứng dụng dịch chủng: Dịch chủng cuối cùng sau đó được chia ra để phục vụ hai mục đích song song:
Gây nhiễm vào các đơn vị mẫu thử: Để tiến hành các nghiên cứu về khả năng gây nhiễm hoặc kiểm tra hiệu quả kiểm soát.
Xác định mức độ dịch chủng: Để kiểm tra lại chính xác nồng độ vi sinh vật thực tế đã sử dụng trong thử nghiệm (thường bằng cách đổ đĩa đếm khuẩn lạc).
Mức cấy ban đầu: Pha loãng để đạt nồng độ mục tiêu ban đầu khoảng 2 log CFU/g (tương đương nồng độ thực tế quan sát từ 1,7 – 2,8 log CFU/g).

Bảng 9.14. Quy mô lấy lấy mẫu kỹ thuật
Hạng mục	Quy mô và kỹ thuật
Số lô hàng	03 lô độc lập, thực hiện trong 3 tuần liên tiếp.
Sản phẩm	Cá hồi hạt lựu (1 cm²), đóng gói môi trường khí thường.
Trọng lượng mẫu	Khoảng 200 g mỗi đơn vị.
Kỹ thuật cấy	Phun dịch cấy lên bề mặt bằng xi lanh chia độ qua màng ngăn.
Mẫu đối chứng	Gồm mẫu không cấy và mẫu cấy nước muối sinh lý.

Tính lượng dịch chủng vi sinh vật Lm cần tiêm

Hỗn hợp nuôi cấy cho thử nghiệm thách thức đánh giá khả năng tăng trưởng có nồng độ ước tính là 9,2 log₁₀cfu/ml, tương đương với 1,58 x 10⁹ cfu/ml.

Nồng độ mục tiêu trong toàn bộ giá thể (matrix) là 100 cfu/g.
Khối lượng của toàn bộ giá thể là 650 g.
Thể tích của dịch chủng nuôi cấy đưa vào giá thể thực phẩm không được vượt quá 1 % khối lượng của toàn bộ giá thể; thể tích tối đa của dịch chủng là 6,5 ml.

Cần phải pha loãng bốn lần theo nồng độ thập phân hỗn hợp nuôi cấy để tiến gần đến nồng độ dịch chủng yêu cầu trong toàn bộ giá thể: C_{hỗn hợp nuôi cấy pha loãng} = 1,58 x 10⁵ cfu/ml.

Cần chuẩn bị một lượng dịch chủng phù hợp để có thể gây nhiễm cho toàn bộ giá thể. Ví dụ 10 ml, khi đó nồng độ của dịch chủng là 1,58 x 10⁴ cfu/ml.

Bước tiếp theo là xác định thể tích dịch chủng cần thiết để gây nhiễm cho 650 g giá thể. Ta có công thức: Đã biết rằng:

C_{lượng dịch chủng} x V_{lượng dịch chủng} = C_{giá thể tổng} x M_{giá thể}

V_{lượng dịch chủng} = (C_{giá thể tổng} x M_{giá thể}) / C_{lượng dịch chủng}

V_{lượng dịch chủng} = (100 cfu/g x 650 g) / (1,58 x 10^⁴cfu/ml) = 4,1 ml

Thể tích cấy vi khuẩn = 4,1 ml

Phương pháp để đạt được nồng độ mục tiêu của chất cấy cũng tương tự như phương pháp thử thách đánh giá tốc độ tăng trưởng tối đa, ngoại trừ điểm xuất phát không phải là hỗn hợp các chủng mà là lần cấy chuyển thứ hai của một chủng duy nhất.

Kỹ thuật cấy: Sử dụng xi lanh tiêm vô trùng phun đều dịch cấy lên bề mặt sản phẩm.

Bước 4: Đóng gói và bảo quản thử nghiệm

Đóng gói: Sản phẩm được duy trì trong bao bì gốc (môi trường không khí).
Điều kiện bảo quản (Kịch bản xấu nhất): Mẫu được ủ ở 10 °C để mô phỏng điều kiện lạm dụng nhiệt độ hợp lý tại cấp độ người tiêu dùng (mẫu lô số 2).
Thời gian thử nghiệm: Kéo dài hơn hạn sử dụng thực tế (có thể lên đến 7) để xây dựng đầy đủ đường cong sinh trưởng.

Bước 5: Phân tích và tính toán kết quả

Lấy mẫu và phân tích vi sinh: Phân tích tại nhiều thời điểm trong suốt quá trình bảo quản để đếm số lượng Lm theo ISO 11290-2.
Kết quả cụ thể cho cá hồi hạt lựu như Bảng 9.15:

Bảng 9.15. Bảng kết quả ví dụ thử nghiệm cá hồi hạt lựu
	Thời điểm t₀		Thời gian t₁		Thời gian t₂		Thời gian t₃		Thời gian t₄		Δ_j	Δ_max
	Lm	± SD*	Lm		Lm		Lm		Lm		Δ_j	Δ_max
Lô 1	2.10 2,28 1,80	2,06 ± 0,24	2,90 1,98 3.10	2,66	3.00 3,86 3,95	3,60	4.12 4,24 4.18	4.18	4,98 4,75 4,73	4,82	4,82 – 2,06 = 2,68	3.30
Lô 2	2.16 2,26 2.18	2,20 ± 0,05	1,80 3.00 3.10	2,63	3,90 3,95 3,97	3,94	4.20 4.31 4,50	4,34	5,80 5.30 5,40	5,50	5,50 – 2,20 = 3,30
Lô 3	2.20 2.04 1,96	2,06 ± 0,12	2,28 2,72 2,85	2,62	3.14 3,53 3,26	3.31	3.25 4.0 3.11	3,45	4,42 4.18 4,50	4,36	4,36 – 2,06 = 2,30
Lô 4	1,48 2,36 2.18	2,00 ± 0,46

Ghi chú: *SD: độ lệch chuẩn.

: Giá trị trung bình

Giải thích Bảng 9.15 như sau:

Tại thời điểm t₀, độ lệch chuẩn của lô 4 bằng 0,46 log₁₀. Giá trị này cao hơn mức dung sai 0,3 log₁₀, có nghĩa là bước cấy giống không được thực hiện đúng cách (dữ liệu outlier). Do đó, thử nghiệm thử thách trên lô 4 đã bị dừng lại, vì việc bắt đầu thử nghiệm thử thách với sự khác biệt lớn như vậy giữa các mẫu đã cấy giống là không thể chấp nhận được. Một thử nghiệm thử thách trên một lô khác (được đặt tên là lô 4 trong bảng) đã được khởi động lại.
Dựa trên kết quả thử nghiệm thử thách được thực hiện trên lô 1, lô 2 và lô 3 trong Bảng 9.15, có thể đánh giá tiềm năng phát triển của Lm trong sản phẩm được thử nghiệm. Giá trị “Δ_max” cao nhất trong 3 lô là 3,30 log₁₀. Tiềm năng tăng trưởng vượt quá tiêu chí 0,5 log₁₀. Vì vậy, thực phẩm ăn liền này hỗ trợ sự phát triển của Lm.

Bước 6: Đánh giá và kết luận

Phân loại: Vì Δ > 0,5 log, sản phẩm được kết luận là “Sản phẩm thực phẩm này hỗ trợ sự tăng trưởng của Lm“.
Ý nghĩa pháp lý: Do sản phẩm hỗ trợ tăng trưởng, nhà sản xuất phải chứng minh vi khuẩn không hiện diện trong 25g trước khi sản phẩm rời khỏi cơ sở sản xuất.

Ứng dụng kết quả xác định Δ để ước lượng sự tăng trưởng:

Trong trường hợp giả định rằng thức ăn có thể hỗ trợ sự phát triển của Lm, giá trị Δ có thể được sử dụng để ước tính sự tăng trưởng (xem các ví dụ bên dưới):

Nồng độ Lm cao nhất trong suốt HSD = nồng độ Lm ban đầu + Δ

Trên thực tế, nồng độ Lm cao nhất thu được từ phép tính trên có thể được sử dụng để xác định xem giới hạn 100 cfu/g có bị vượt quá hay không trong suốt thời hạn sử dụng của thực phẩm.

Ví dụ: tiềm năng tăng trưởng là: Δ = 3,30 log ₁₀

Nếu Δ cao hơn nhiều so với 0,5 log₁₀, thì người ta cho rằng thức ăn hỗ trợ sự phát triển của Lm và thuộc loại 1.2 của Quy định (EC) 2073/2005.
Do đó, để đảm bảo rằng sự nhiễm bẩn Lm sẽ không vượt quá giới hạn 2 log cfu/g vào cuối thời hạn sử dụng, nồng độ ban đầu của Lm (Ci) phải rất thấp, tức là dưới 0,05 cfu/g (Ci = 2,0 – 3,30 = -1,3 log cfu/g).

3.3. Thử nghiệm thử thách đánh giá tốc độ tăng trưởng tối đa

Thử nghiệm thử thách vi sinh vật đánh giá tốc độ tăng trưởng tối đa là một nghiên cứu trong phòng thí nghiệm nhằm ước tính sự phát triển của Lm trong thực phẩm được gây nhiễm nhân tạo với từng chủng Lm một tại một thời điểm và được bảo quản ở nhiệt độ không đổi (thường từ 6 ⁰C đến 10 ⁰C) trong suốt thời gian thử nghiệm.

Tốc độ tăng trưởng tối đa μ_max là thông số động học đặc trưng cho sự gia tăng quần thể Lm trong pha log (pha lũy thừa) của đường cong tăng trưởng theo thang logarit tự nhiên (Ln). Từ đường cong tăng trưởng thực nghiệm thu được bằng cách vẽ biểu đồ nồng độ Lm (biểu thị bằng log₁₀ cfu/g) theo thời gian (biểu thị bằng giờ hoặc ngày), tốc độ tăng trưởng tối đa được ký hiệu là V_max. Để chuyển đổi từ đơn vị này sang đơn vị kia, mối liên hệ:

μ_max = V_max x Ln(10) = V_max x 2,3.

Trong các tài liệu khoa học và trong hầu hết các công cụ dự đoán vi sinh vật, tốc độ tăng trưởng tối đa thường được báo cáo là μ_max, để tránh nhầm lẫn, việc chú ý đến các đơn vị là rất thiết yếu.

Thời gian của một thử nghiệm thử thách đánh giá tốc độ tăng trưởng tối đa có thể khác với thời gian hạn sử dụng của sản phẩm. Thời gian của nó được xác định bởi thời gian cần thiết để xây dựng đường cong tăng trưởng ở nhiệt độ đã chọn.

Ưu điểm của thử nghiệm thử thách đánh giá tốc độ tăng trưởng tối đa là tính linh hoạt: khi được xác định trong một điều kiện thời gian và nhiệt độ nhất định, tốc độ tăng trưởng có thể được ước tính trong các điều kiện thời gian/nhiệt độ khác mà không cần thực hiện một thử nghiệm thử thách khác, với điều kiện là các giá trị cơ bản của chủng nghiên cứu đã được biết.

Nhược điểm của thử nghiệm thử thách này là không xem xét đến ảnh hưởng của pha tiềm phát (lag phase), điều này có thể dẫn đến nồng độ Lm ước tính khác nhau tùy thuộc vào việc nó có được tính đến hay không. Ví dụ cực đoan nhất có lẽ là thực phẩm được xử lý HPP, nơi sẽ có pha tiềm phát dài, nhưng sự tăng trưởng theo lũy thừa vẫn lớn như thể thực phẩm không được xử lý nhiệt.

3.3.1 Quy trình thử nghiệm thử thách để đánh giá tốc độ tăng trưởng tối đa

Đối với các phần về “Gây nhiễm các đơn vị thử nghiệm” và “Đo lường các thông số lý-hóa của sản phẩm”, tương tự như phần về tiềm năng tăng trưởng.

Các phần dưới đây là đặc thù cho quy trình đánh giá tốc độ tăng trưởng tối đa.

3.3.1.1. Số lượng lô

Theo quy định, ít nhất 3 lô phải được kiểm tra để xác định hạn sử dụng vi sinh của một thực phẩm RTE, nhằm có thể ghi nhận sự biến thiên giữa các lô. Tuy nhiên, dựa trên công cụ tính toán “Inter-Batch Physico-Chemical Variability calculator” có tại http://standards.iso.org/iso/20976/-1/ed-1/en, đi kèm với tiêu chuẩn EN-ISO 20976-1, thử nghiệm thử thách có thể được thực hiện chỉ với một lô, nếu:

Tổ chức có thể cung cấp dữ liệu về các yếu tố đặc trưng của sản phẩm trong một lô (biến thiên nội lô) và giữa các lô (biến thiên giữa các lô);
Các thông số lý-hóa, pH và a_w, là những yếu tố chính tác động đến sự phát triển của Lm trong sản phẩm;
Tác động của sự biến thiên giữa các lô đối với các thông số lý-hóa này lên sự phát triển của Lm được coi là không đáng kể (kết quả của công cụ tính toán).

Việc sử dụng công cụ tính toán này chỉ phù hợp cho các thử nghiệm thử thách được thực hiện để đánh giá tốc độ tăng trưởng tối đa.

3.3.1.2. Lựa chọn chủng

Mỗi thử nghiệm kiểm tra chỉ sử dụng một chủng vi khuẩn duy nhất. Do đó, việc lựa chọn chủng phải cực kỳ cẩn trọng dựa trên hai tiêu chí: có đặc tính tăng trưởng rõ ràng và phù hợp với loại thực phẩm đang nghiên cứu. Chủng này có thể được chọn từ bộ chủng Lm của EURL Lm đặc trưng bởi tốc độ tăng trưởng tối đa của chúng ở nhiệt độ thấp, pH và a_w. Có thể đặt hàng từ các Phòng thí nghiệm tham chiếu quốc gia về Lm. Việc sử dụng các chủng như vậy sẽ cho phép dự đoán sự phát triển của chủng trong thực phẩm nghiên cứu dưới các điều kiện môi trường khác nhau, không được kiểm tra trong thử nghiệm thử thách, một cách chính xác hơn.

3.3.1.3. Chuẩn bị dịch cấy

Các điều kiện để chuẩn bị dịch cấy tương tự như các điều kiện được mô tả cho thử nghiệm thử thách đánh giá tiềm năng tăng trưởng, ngoại trừ việc chủng được nuôi cấy và sử dụng riêng lẻ.

3.3.1.4. Gây nhiễm các đơn vị thử nghiệm

Các điều kiện để gây nhiễm các đơn vị thử nghiệm tương tự như các điều kiện được mô tả cho thử nghiệm thử thách đánh giá tiềm năng tăng trưởng, ngoại trừ việc gây nhiễm được thực hiện với một chủng duy nhất chứ không phải với hỗn hợp các chủng cho mỗi đường cong tăng trưởng.

3.3.1.5. Số lượng đơn vị – Số lượng điểm lấy mẫu

Tham khảo EN ISO 20976-1 cho các phần liên quan đến:

Số lượng đơn vị cần chuẩn bị (số lượng đơn vị thử nghiệm cần gây nhiễm, số lượng đơn vị kiểm chứng và mẫu thực phẩm kiểm chứng).
Số lượng điểm lấy mẫu.

Phần này tính toán tương tự như mục đánh giá Tiềm năng tăng trưởng Lm.

3.3.1.6. Điều kiện bảo quản

Thử nghiệm thử thách được thực hiện ở một nhiệt độ không đổi. Nhiệt độ bảo quản nên nằm trong khoảng từ 6 ⁰C đến 10 ⁰C. Trong trường hợp sản phẩm bị nhiễm vi khuẩn lactic thì nhiệt độ không được quá 8 ⁰C, để tránh sự ức chế tăng trưởng bởi vi khuẩn lactic ở nhiệt độ cao hơn. Thời gian của thí nghiệm phải đủ dài để xây dựng đường cong tăng trưởng và thời gian này có thể dài hơn hoặc ngắn hơn thời hạn sử dụng được nghiên cứu.

3.3.1.7. Phân tích vi sinh

Tương tự như phần đánh giá tiềm năng tăng trưởng Lm, ngoại trừ việc phát hiện Lm được thực hiện trong mẫu thực phẩm kiểm chứng tại thời điểm 0. Khi phát hiện thấy Lm trên lô nghiên cứu trong mẫu thực phẩm kiểm chứng, thử nghiệm thử thách sẽ bị dừng lại (do việc gây nhiễm đơn chủng trong thử nghiệm thử thách đánh giá tốc độ tăng trưởng tối đa).

3.3.1.8. Tính toán tốc độ tăng trưởng tối đa

Đối với mỗi đường cong tăng trưởng (một đường cong tăng trưởng cho mỗi lô), tốc độ tăng trưởng tối đa có thể được ước tính dễ dàng bằng cách khớp mô hình sơ cấp (hồi quy phi tuyến) trên tất cả các điểm thực nghiệm của đường cong tăng trưởng. Việc khớp này có thể được thực hiện bằng cách sử dụng các phần mềm dự đoán vi sinh có sẵn miễn phí, ví dụ: DMFit từ phần mềm ComBase (www.combase.cc) hoặc Curve fitting từ Sym’Previus (www.symprevius.eu).

Tốc độ tăng trưởng tối đa ước tính của sản phẩm thử nghiệm được xác định từ thử nghiệm thử thách bằng giá trị trung bình (biểu thị cùng với độ lệch chuẩn của nó) của các giá trị tốc độ tăng trưởng tối đa thu được từ các đường cong tăng trưởng (ít nhất một đường trên mỗi lô). Để xây dựng đường cong tăng trưởng, cần chú ý đến việc phân bố các điểm thực nghiệm theo thời gian, nhằm có thể ước tính chính xác tốc độ tăng trưởng tối đa. Để mô hình sơ cấp khớp tốt với các điểm dữ liệu thực nghiệm, điều quan trọng là phải có một điểm ở đầu pha dừng và một điểm muộn hơn trong cùng pha đó (xem ví dụ Hình 9.8).

Tùy thuộc vào phần mềm được sử dụng để ước tính tốc độ tăng trưởng tối đa, kết quả không được đưa ra trong cùng một đơn vị. Trên DMFit, nếu dữ liệu đầu vào là log₁₀ cfu/g, thì V_max được tính bằng log₁₀ cfu/g, sau đó cần nhân nó với 2,3 để thu được μ_max tương ứng. Trên Sym’Previus, dữ liệu đầu vào là log₁₀ cfu/g và tốc độ tăng trưởng tối đa (μ_max) được đưa ra và luôn được biểu thị bằng Ln cfu/g.

Lưu ý rằng, nếu mức tăng quần thể vi sinh vật quan sát được từ đường cong tăng trưởng là nhỏ (< 1 log cfu/g), điều này không cho phép xác định μ_max một cách đáng tin cậy. Trong trường hợp đó, có thể khuyến nghị xây dựng một đường cong tăng trưởng khác ở nhiệt độ cao hơn để khớp mô hình hoặc thực hiện nghiên cứu tiềm năng tăng trưởng. Nếu một sản phẩm bị nghi ngờ là không thể hỗ trợ sự phát triển của Lm dựa trên các đặc tính lý – hóa, thì không thể ước tính tốc độ tăng trưởng tối đa một cách đáng tin cậy. Một thử nghiệm đánh giá tiềm năng tăng trưởng nên được thực hiện để chứng minh điều này.

Cuối cùng, điều quan trọng là phải đánh giá độ không đảm bảo đo xung quanh tốc độ tăng trưởng tối đa ước tính (μ_max) được phản ánh bởi sai số chuẩn (se) hoặc khoảng tin cậy (CI) xung quanh giá trị μ_max ước tính. Điều quan trọng là sai số chuẩn không vượt quá 20 % giá trị μ_max ước tính. Nếu không, điều này có nghĩa là có độ không đảm bảo cao liên quan đến μ_max, và kết quả này nên được diễn giải một cách thận trọng.

3.3.2.9. Ứng dụng kết quả

Tổ chức chịu trách nhiệm về việc sử dụng các kết quả của thử nghiệm thử thách. Tốc độ tăng trưởng tối đa có thể được sử dụng để đánh giá sự gia tăng quần thể Lm trong thời hạn sử dụng của sản phẩm dưới các nhiệt độ bảo quản khác nhau. Từ động học tăng trưởng của thử nghiệm thử thách thu được ở một nhiệt độ không đổi (T⁰_CT), có thể ước tính tốc độ tăng trưởng ở một nhiệt độ khác (T⁰).

Tốc độ tăng trưởng được xác định bằng cách khớp mô hình sơ cấp (ví dụ: DMFit) với động học tăng trưởng được ký hiệu là Tốc độ tăng trưởng _CT. Sau đó, việc tính toán tốc độ tăng trưởng trong cùng một loại thực phẩm (cùng đặc tính lý-hóa) ở một nhiệt độ khác T⁰có thể thu được bằng cách sử dụng các mô hình thứ cấp.

Phương trình rút gọn sau đây (Ratkowski et al., 1982) (Mejlholm et al., 2010) của mô hình thứ cấp căn bậc hai có thể được sử dụng (nếu chỉ xem xét nhiệt độ trong mô phỏng và nếu cả T⁰ và T_CT đều dưới 25 ⁰C):

Tốc độ tăng trưởng _T⁰₌Tốc độ tăng trưởng _TCx	(T⁰ – T_min)²
	(T_CT – T_min)²

Trong đó T_min là nhiệt độ tăng trưởng tối thiểu của Lm (-2 ⁰C là giá trị mặc định được đưa ra trong Bảng 9.16 có thể được sử dụng cho tất cả các chủng như một giá trị chung).

*Bảng 9.16. Đặc điểm sinh trưởng/sống sót của L. monocytogenes* (tùy thuộc chủng) trong môi trường canh thang**
	Tối thiểu (giới hạn tăng trưởng dưới)	Tối ưu (Tăng trưởng nhanh nhất)	Tối đa (Giới hạn tăng trưởng trên)	Sống sót (nhưng không phát triển)
Nhiệt độ ( °C)	-2	30 – 37	45	– 18
độ pH	4,0 – 4,3	7,0	9,6	3,3 – 4,2
a_w	0,92 ( 0,90 với glycerol )	0,99	/	< 0,90
Hàm lượng NaCl			12	≥ 20
Khí quyển	Vi khuẩn kỵ khí tùy ý và vi hiếu khí (có khả năng phát triển khi có hoặc không có O₂). (ví dụ: trong môi trường chân không hoặc khí quyển được điều chỉnh)

Nguồn: Đặc điểm sinh trưởng của Lm tham khảo bảng dữ liệu Anses về các mối nguy sinh học “Listeria monocytogenes”, 2020 và đặc điểm khả năng sống sót của Lm tham khảo tài liệu hướng dẫn của EC/DG SANCO về nghiên cứu thời hạn sử dụng của Listeria monocytogenes đối với thực phẩm ăn liền, theo Quy định (EC) số 2073/2005 ngày 15 tháng 11 năm 2005 về các tiêu chí vi sinh đối với thực phẩm”.

Mức tăng Lm (tính theo log₁₀) cho thời gian bảo quản d₁ (tính theo ngày) tại:

T_CT = Tốc độ tăng trưởng_CT x (log₁₀ cfu/g trên ngày) x d₁

Mức tăng Lm (tính theo log₁₀) cho thời gian bảo quản d₂ (tính theo ngày) tại:

T⁰ = Tốc độ tăng trưởng _T⁰ x (log₁₀ cfu/g trên ngày) x d2

Lưu ý: Đối với tính toán này, tốc độ tăng trưởng tối đa phải được biểu thị bằng log₁₀ (= V_max).

Ví dụ: Ước tính sự gia tăng dân số Lm không có độ trễ thời gian

Tiến hành cấy mẫu như phần 3.2 và 3.3 ta có dữ liệu như bảng 9.17 sau:

Bảng 9.17. Dữ liệu thí nghiệm
Thời gian (Ngày)	Nồng độ (CFU/g)	Log CFU/g)	Ghi chú
0.00	117.49	2.070	Mới cấy
1.00	218.78	2.340
2.00	218.78	2.340
3.00	630.96	2.800	Tăng trưởng
4.00	5,888.44	3.770
7.00	239,883.29	5.380
8.00	2,818,382.93	6.450
9.00	15,135,612.48	7.180
10.00	50,118,723.36	7.700
11.00	251,188,643.15	8.400	Cân bằng
14.00	398,107,170.55	8.600	Suy vong
17.00	316,227,766.02	8.500

Từ dữ liệu Bảng 9.17 tiến hành nhập lên DMFit từ phần mềm ComBase ta được Hình 9.8.

Hình 9.8. Việc đo đạc được thực hiện bằng phần mềm DMFit của ComBase (www.combase.cc)

Dữ liệu từ nhà sản xuất như sau:

Sản phẩm có thời hạn sử dụng 9 ngày (“ngày 0” là ngày sản xuất);
Điều kiện bảo quản: 4 °C trong 3 ngày (d1) và 8 °C trong 6 ngày (d2);
Thử nghiệm độ bền được thực hiện trên sản phẩm này ở nhiệt độ T _CT= 8 °C.

Tốc độ tăng trưởng tối đa (cùng với sai số chuẩn) ước tính ở 8 °C từ phép hiệu chỉnh:

Tốc độ tăng trưởng _CT= Maximum rate = 0,764 log₁₀cfu/g.d^-1± 0,0367 (Hình 9.8).

Hình dạng trực quan của đường cong cho thấy các điểm dữ liệu mô tả toàn bộ đường cong hình chữ S. Nếu ta chia sai số chuẩn liên quan đến tốc độ tăng trưởng cho giá trị của nó, ta được: 0,0367/0,764 = 4,8 %. Con số này thấp hơn ngưỡng không chắc chắn 20 % và cho thấy ước tính tốc độ tăng trưởng này là chính xác.

Việc sử dụng phương trình đơn giản hóa của mô hình căn bậc hai thứ cấp cho phép ước tính tốc độ tăng trưởng ở nhiệt độ T° = 4 °C. Tốc độ tăng trưởng tối đa ở 4 °C ước tính từ phương trình trên của mô hình thứ cấp là:

Tốc độ tăng trưởng _T⁰₌Tốc độ tăng trưởng _TCx	(T⁰ – T_min)²
	(T_CT – T_min)²

Tốc độ tăng trưởng T° (4 °C) = 0,275 log ₁₀cfu/g.d ^-1

Ứng dụng tốc độ tăng trưởng để tính thời hạn sử dụng:

Ước tính tốc độ tăng trưởng của Lm trong suốt thời gian bảo quản = [(tốc độ tăng trưởng_[1](4 °C) tính bằng log ₁₀cfu/g trên ngày) x d₁] + (tốc độ tăng trưởng_[2](8 °C) tính bằng log ₁₀cfu/g trên ngày) x d₂]. Trong đó:

Tốc độ tăng trưởng T° (4 °C) = 0,275 log ₁₀cfu/g.d ^-1
Tốc độ tăng trưởng T_CM (8 °C) = 0,764 log₁₀cfu/g.d^-1
Thời gian d₁ = 3 ngày
Thời gian d₂ = 6 ngày

Ước tính mức tăng trưởng của Lm trong HSD = (0,275 x 3) + (0,764 x 6) = 5,42 log₁₀

Phép tính đơn giản này không bao gồm giai đoạn chậm phát triển, cũng như giai đoạn ổn định (tức là giả định sự tăng trưởng theo cấp số mũ trong suốt thời hạn sử dụng) và do đó thể hiện kịch bản xấu nhất. Để khắc phục thiếu sót này, có thể sử dụng phần mềm dự đoán vi sinh.

Khi tính đến thời gian trễ trong quá trình ước tính thời hạn sử dụng, cần phải thận trọng vì khó đánh giá trạng thái sinh lý của Lm khi sản phẩm bị nhiễm bẩn. Việc lựa chọn đưa giai đoạn trễ vào cần được biện minh/giải thích.

Ứng dụng để ước tính sự gia tăng dân số Lm, trong đó có bao gồm độ trễ thời gian.

Ta có dữ liệu ở trên:

Sản phẩm có thời hạn sử dụng 9 ngày (“ngày 0” là ngày sản xuất);
Bảo quản ở nhiệt độ 4 °C trong 9 ngày;
Thử nghiệm độ bền đã được thực hiện trên sản phẩm này tại T_CT= 8 °C.

Dựa trên Hình 9.8 thực hiện ở 8 °C, thời gian pha trễ (Lag/shouder) được ước tính là 2,346 ± 0,367 ≈ 2,35 ngày.

Theo Baranyi và Roberts (1994), độ trễ có mối quan hệ với h₀ như sau:

h₀ = λ x V_max, với:

h₀ là hằng số đại diện cho tổng lượng công việc hay nỗ lực nội tại mà tế bào vi khuẩn phải thực hiện để thích nghi với môi trường mới trước khi có thể bắt đầu phân chia.
λ: thời gian pha trễ;
V_max: tốc độ tăng trưởng tối đa.

Theo phép tính ở 8 °C, h₀= 0,764 x 2,35 = 1,79.

Để tính thời gia pha trễ (λ) ở 4 °C ta sử dụng công thức h₀ ở trên suy ra λ.

= = 6,5 ngày.

Với λ (4 ⁰C) = 6,5 ngày, điều này có nghĩa là sự phát triển của Lm sẽ bắt đầu sau 6,5 ngày ở 4 °C, tức là sẽ không có sự phát triển nào trong 6,5 ngày đầu tiên ở 4 °C.

Với hạn sử dụng là 9 ngày, 6,5 ngày đầu Lm hầu như ít phát triển, tính thời gian bảo quản còn lại là lấy hạn sử dụng của sản phẩm trừ đi thời gian pha trễ ở nhiệt độ đó. Tức là:

Mức tăng trưởng trong thời gian còn lại (t_{lưu kho}) = (9 – 6,5) = 2,5 ngày ở 4 °C.

Từ đây, ta có thể suy ra mức tăng trưởng ước tính của Lm trong suốt thời gian bảo quản được như sau:

Mức tăng trưởng Lm trong HSD = Mức tăng trưởng ở pha trễ + (V_max x t_{lưu kho}). Trong đó, trong pha trễ vi sinh vật hầu như không tăng trưởng nên chúng bằng 0.

Mức tăng trưởng Lm trong HSD (9 ngày) = (0) + (0,275 x 2,5) = 0,69 log₁₀.

Tác giả: Nguyễn Hoàng Em

Xem bảng đầy đủ link: https://quantri24h.com/wp-content/uploads/2026/05/Huong-dan-tham-dinh-bien-phap-kiem-soat-CCP-Cho.pdf

Tài liệu tham khảo:

1. EURL , tài liệu hướng dẫn kỹ thuật EURL Lm về các thử nghiệm thách thức và nghiên cứu độ bền để đánh giá thời hạn sử dụng của thực phẩm ăn liền liên quan đến Listeria monocytogenes , Phiên bản 4 ngày 1 tháng 7 năm 2021.

2. Ủy ban Châu Âu, Tài liệu hướng dẫn về giám sát Listeria monocytogenes và nghiên cứu thời hạn sử dụng của thực phẩm ăn liền theo Quy định của Ủy ban (EC) số 2073/2005 ngày 15 tháng 11 năm 2005 về các tiêu chí vi sinh đối với thực phẩm , SANCO/11510/2013, sửa đổi ngày 18 tháng 12 năm 2025.

3. ISO 20976-1:2019, Vi sinh vật học chuỗi thực phẩm – Yêu cầu và hướng dẫn thực hiện thử nghiệm thách thức đối với thực phẩm và thức ăn chăn nuôi – Phần 1: Thử nghiệm thách thức để nghiên cứu tiềm năng tăng trưởng, thời gian trễ và tốc độ tăng trưởng tối đa (ISO 20976-1:2019).

Categories: BÀI ĐĂNG, Hệ Thống Quản Lý theo ISO, ISO 22 000 : 2018

Tags: Bài Đăng

About Author

admin

Write a Comment

Website này sử dụng Akismet để hạn chế spam. Tìm hiểu bình luận của bạn được duyệt như thế nào.